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Uhlenbrock, C. (2010). Nachweis von ranavirusinfektionen bei landschildkröten und charakterisierung von virusisolaten. Unpublished thesis , Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen.
Added by: Sarina Wunderlich (30 Oct 2011 14:52:44 UTC) |
| Resource type: Thesis/Dissertation BibTeX citation key: Uhlenbrock2010 View all bibliographic details  |
Categories: General Keywords: Schildkröten = turtles + tortoises, Testudinidae, Testudo, Testudo graeca, Testudo hermanni, Testudo kleinmanni, Testudo marginata, Veterinärmedizin = veterinary medicine, Viren = viruses Creators: Uhlenbrock Publisher: Justus-Liebig-Universität Gießen (Gießen) |
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| Abstract |
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Testudinidae Im Rahmen dieser Arbeit wurden Erkrankungen nach einer Infektion mit Ranavirus bei Landschildkröten (Testudo hermanni, Testudo marginata, Testudo graeca und Testudo kleinmanni) aus acht verschiedenen Beständen in Deutschland untersucht. Acht Virusisolate (882/96, 4152/07, 5187/07, 5810/07, 6172/07, 354/08, CU10/08 und CU60/09) aus diesen Beständen wurden eingehend analysiert. Zum Vergleich wurden zwei Ranavirusisolate aus Amphibien, die Typspezies Frog virus 3 (FV-3) und das Isolat 1834/04 aus einem Kweichow Krokodilmolch (Tylototriton kweichowensis), mitgeführt. Die Bestätigung dieser zehn Isolate als Angehörige des Genus Ranavirus, Familie Iridoviridae, erfolgte mittels Chloroform- und IUDR-Test, der Ranavirus-spezifischen PCR sowie des Ranavirus-typischen cpE in der TH-1-Zellkultur. Die Vermehrung der zehn Isolate wurde in verschiedenen Zellkulturen (TH-1, VH2, SFT, Na, MDBK, BGM, BHK und KOP) bei 28 °C und 37 °C untersucht. Alle Isolate vermehrten sich bei einer Inkubationstemperatur von 28 °C, jedoch nicht bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C. Am stärksten vermehrten sich die Isolate in der TH-1-Zellkultur (mindestens KID50 von 1010,4 je ml), so dass eine Inkubation bei 28 °C auf TH-1-Zellen als Methode der Wahl zur Isolierung von Ranavirus in Zellkulturen zu empfehlen ist. Bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C zeigten sich in einigen Zelllinien (BGM, BHK, KOP, SFT und Na) zytopathische Veränderungen, eine Virusvermehrung war aber nicht nachweisbar. Der cpE wurde in diesen Zellkulturen vermutlich durch einen toxischen Effekt der Ranaviren hervorgerufen. Nach der Spaltung des gesamten Genoms mit den Enzymen EcoRI, HindIII, XbaI und KpnI sowie bei der Sequenzanalyse eines Teils des MCP-Gens zeigte sich, dass die acht Ranavirusisolate aus Schildkröten untereinander identisch (4152/07, 5187/07, 5810/07, 354/08, CU10/08 und CU60/09) bzw. sehr nahe verwandt (882/96 und 6172/07) sind. Die beiden Ranavirusisolate aus Amphibien (FV-3 und 1834/04) wiesen bei der Restriktionsenzymanalyse eine maximale Übereinstimmung von 33,3 % zu den Ranavirusisolaten aus Schildkröten auf, so dass die von mir untersuchten Isolate aus Schildkröten nach der Definition von CHINCHAR et al. (2005) einen eigenen phylogenetischen Virusstamm bilden. Auch der Vergleich dieser Schildkrtenisolate mit in den DNA-Sequenz- datenbanken hinterlegten Sequenzen anderer Ranaviren ergab keine nahe Verwandtschaft, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die bisher aufgetretenen Erkrankungsf.lle in Deutschland von einem einzigen, bisher nicht in den DNA-Sequenzdatenbanken hinterlegten Ranavirus hervorgerufen wur- den. Die bestehenden Methoden zum Nachweis von Ranaviren wurden .berpr.ft. Es zeigte sich, dass der Nachweis von Ranavirus mittels PCR deutlich h.ufiger gelang als mittels Zellkultur (Signifikanz von p<0,001). Von den 400 untersuch- ten Organ- und Tupferproben waren 133 positiv in der PCR und nur 10 positiv in der TH-1-Zellkultur. Bei Verwendung eines Membranfilters mit einer mittleren Porenweite von 0,45 μm statt 0,2 μm zum Filtrieren der Probensuspensionen vor Inokulation der TH-1-Zellkultur lie sich aus 2 von 38 vorher nur in der PCR positiven Tupferproben Ranavirus in der TH-1-Zellkultur isolieren. In den Versu- chen zur Optimierung der PCR-Methode durch Ver.nderung der Zusammen- setzung des Mastermixes, der Probenmenge, der Temperatur sowie der Zyk- lenanzahl und -dauer zeigten sich kaum Unterschiede zu der bisher verwende- ten Methode von MAO et al. (1997). Bei epidemiologischen Untersuchungen gelang der Virusnachweis mittels PCR in Rachentupferproben ehemals erkrankter Schildkrten bis zu acht Wochen l.nger als in Kloakentupferproben. Bis zu sieben Wochen nach der Genesung von einer spontanen Infektion lieen sich Teile des Ranavirusgenoms in Ra- chentupferproben nachweisen. Es konnte nicht bewiesen werden, dass nach- gewiesene Teile des Ranavirusgenoms immer von vermehrungsf.higem Virus stammen. In einigen F.llen konnte jedoch vermehrungsf.higes Virus isoliert werden bzw. schien aufgrund des Krankheitsverlaufs das Vorliegen von ver- mehrungsf.higem Virus sehr wahrscheinlich. Bisher bestand in Europa keine Mglichkeit zum Nachweis von Ranavirus- spezifischen Antikrpern im Serum oder Blutplasma von Schildkrten. Aus die- sem Grund war es ein weiterer wichtiger Teil meiner Arbeit, ein geeignetes Testverfahrens zum Antikrpernachweis zu etablieren. Mittels klassischen Neutralisationstests in TH-1-Zellkulturen lieen sich keine neutralisierenden Antikörper nachweisen. Daher wurde von mir ein ELISA zum Antikörpernachweis entwickelt und auf Spezifität und Sensitivität überprüft. 227 Seren von erkrankten, genesenen und unverdächtigen Schildkröten wurden mit diesem ELISA auf das Vorhandensein von Ranavirus-spezifischen Antikörpern untersucht. Bei allen genesenen Schildkröten ließen sich Antikörper nachweisen. Alle Schildkröten ohne bekannte Ranavirusinfektion wiesen keine Antikörper auf. Es wurden Untersuchungen zum Verlauf der Antikörpertiter durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Antikörpertiter über den untersuchten Zeitraum (bis zu zwei Jahren) stetig anstiegen. Die Dauer bis zum Beginn der Bildung nachweisbarer Antikörper sowie die Höhe der Antikörpertiter scheinen von der Schwere der vorausgehenden Erkrankung abhängig zu sein. Schildkröten, die schwere Krankheitssymptome gezeigt hatten, wiesen früher höhere Antikörpertiter (z. B. ELISA-Wert 37,94/18,97 zwei Jahre nach der Erkrankung) auf als Schildkröten, die nur leicht erkrankt waren (z. B. ELISA-Wert 12,71/3,43 zwei Jahre nach der Erkrankung).
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